一、細(xì)胞培養(yǎng)液簡(jiǎn)介
細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)最早是在19世紀(jì)末就開(kāi)始了，但用于培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)液主要是動(dòng)物的血清或淋巴液。被人稱為細(xì)胞培養(yǎng)之父的Ross?Harrison就是利用青蛙的淋巴液來(lái)培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞的。這樣的培養(yǎng)液不但性質(zhì)不穩(wěn)定，而且只能進(jìn)行非常小規(guī)模的細(xì)胞培養(yǎng)。第一個(gè)人工配制的培養(yǎng)液是由Lewis在1911年由海水、血清、胚胎提取物和鹽和蛋白胨為原料配制成的。但是人們對(duì)于培養(yǎng)液中的化學(xué)成分并不清楚。直到1948年，F(xiàn)isher才研制成了第一個(gè)化學(xué)成分清楚的細(xì)胞培養(yǎng)液CMRL1006。實(shí)驗(yàn)室常用的細(xì)胞培養(yǎng)液的主要成分是氨基酸、葡萄糖、無(wú)機(jī)鹽、維生素和微量元素等。為了維持穩(wěn)定的pH，培養(yǎng)液中一般有一個(gè)pH緩沖系統(tǒng)，同時(shí)常加入少量的酚紅作為pH 指示劑。另外培養(yǎng)液中一般需要加入一定量的血清。
二、細(xì)胞培養(yǎng)中實(shí)驗(yàn)配制細(xì)胞培養(yǎng)液所需材料及試劑
胰蛋白酶，青霉素，鏈霉素，PBS，Hanks ，HEPES 溶液，谷氨酰胺，肝素鈉，明膠溶液，純凈水系統(tǒng)、電子天平、PH 計(jì)、磁力攪拌器等。
三、細(xì)胞培養(yǎng)中實(shí)驗(yàn)配制細(xì)胞培養(yǎng)液的步驟
1. 水的制備：
細(xì)胞培養(yǎng)用水必須非常純凈，不含有離子和其他的雜質(zhì)。需要用新鮮的雙蒸水、三蒸水或純凈水.
2.PBS 的制備與消毒( 也可用于其它BSS ，如：Hanks ，D-Hanks 液的配制) ：
(1) 溶解定容：將藥品（NaCl 8.0g ，KCl 0.2g ，Na2 HPO4? H2 O 1.56g ，KH2 PO4 0. 2g ）倒入盛有雙蒸水的燒杯中，玻璃棒攪動(dòng)，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中準(zhǔn)確定容至1000ml ，搖勻即成新配制的PBS 溶液。
(2) 移入溶液瓶?jī)?nèi)待消毒：將PBS 倒入溶液瓶（大的吊針瓶）內(nèi)，蓋上膠帽，并插上針頭放入高壓鍋內(nèi)8 磅消毒20 分鐘。注意高壓消毒后要用滅菌蒸餾水補(bǔ)充蒸發(fā)掉的水份。
3. 胰蛋白酶溶液的配制與消毒：
胰蛋白酶的作用是使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解從而使細(xì)胞離散。不同的組織或者細(xì)胞對(duì)胰酶的作用反應(yīng)不一樣。胰酶分散細(xì)胞的活性還與其濃度、溫度和作用時(shí)間有關(guān)，在pH 為8.0 、溫度為37℃ 時(shí)，胰酶溶液的作用能力最強(qiáng)。使用胰酶時(shí)，應(yīng)把握好濃度、溫度和時(shí)間，以免消化過(guò)度造成細(xì)胞損傷。因Ca2+ 、Mg2+ 和血清、蛋白質(zhì)克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液時(shí)應(yīng)選用不含Ca2+ 、Mg2+ 的BSS ，如：D-Hanks 液。終止消化時(shí)，可用含有血清培養(yǎng)液或者胰酶抑制劑終止胰酶對(duì)細(xì)胞的作用。
(1)稱取胰蛋白酶： 按胰蛋白酶液濃度為0.25 ％，用電子天平準(zhǔn)確稱取粉劑溶入小燒杯中的雙蒸水（若用雙蒸水需要調(diào)PH 到7.2 左右）或PBS （D-hanks ）液中。攪拌混勻，置于4℃ 內(nèi)過(guò)夜。
(2)用注射濾器抽濾消毒：配好的胰酶溶液要在超凈臺(tái)內(nèi)用注射濾器（0.22 微米微孔濾膜）抽濾除菌。然后分裝成小瓶于-20℃ 保存以備使用。
4. 青鏈霉素溶液的配制與消毒流程
(1)所用純凈水（雙蒸水）需要15 磅高壓20 分鐘滅菌。
(2)具體操作均在超凈臺(tái)內(nèi)完成。青霉素是80 萬(wàn)單位/ 瓶，用注射器加4ml 滅菌雙蒸水。鏈霉素是100 萬(wàn)單位/ 瓶，加5ml 滅菌雙蒸水，即每毫升各為20 萬(wàn)單位。
(3)使用時(shí)溶入培養(yǎng)液中，使青鏈霉素的濃度最終為100 單位/ml 。
5. RPMI1640 的制備與消毒：
(1)溶解、調(diào)PH 值、定容：先將培養(yǎng)基粉劑加入培養(yǎng)液體積2/3 的雙蒸水中, 并用雙蒸水沖洗包裝袋2-3 次( 沖洗液一并加入培養(yǎng)基中), 充分?jǐn)嚢柚练蹌┤咳芙? 并按照包裝說(shuō)明添加一定的藥品. 然后用注射器向培養(yǎng)基中加入配制好的青鏈霉素液各0.5ml, 使青鏈霉素的濃度最終各為100 單位/ml 。然后用一個(gè)當(dāng)量的鹽酸和NaOH 調(diào)PH 到7.2 左右。最后定容至1000ml ，搖勻。
(2)安裝蔡式濾器：安裝時(shí)先裝好支架，按規(guī)定放好濾膜，用螺絲將不銹鋼濾器和支架連接好。然后卸下支架腿分別用布包好待消毒。
(3)抽濾：配制好的培養(yǎng)液通常用濾器過(guò)濾除菌。通常用蔡式濾器在超凈工作臺(tái)內(nèi)過(guò)濾。
(4)分裝：將過(guò)濾好的培養(yǎng)液分裝入小瓶?jī)?nèi)置于4℃ 冰箱內(nèi)待用。
(5)使用前要向100ml 培養(yǎng)液中加入1ml 谷氨酰胺溶液（4℃ 時(shí)兩周有效）。
6. 血清的滅活步驟：
細(xì)胞培養(yǎng)常用的是小牛血清，新買來(lái)的血清要在56℃ 水浴中滅火30 分鐘后，再經(jīng)過(guò)抽濾方可加入培養(yǎng)基中使用。
7.HEPES 溶液的配置：
HEPES 的化學(xué)全稱是4-羥乙基哌嗪乙磺酸。對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性作用。它是一種氫離子緩沖劑，能較長(zhǎng)時(shí)間控制恒定的pH 范圍。使用終濃度為10-50mmol/L ，一般培養(yǎng)液內(nèi)含20mmol/LHEPES 即可達(dá)到緩沖能力。
1mol/L HEPES 緩沖液配制方法如下：
準(zhǔn)確稱取HEPES 238.3g ，加入新鮮三蒸水定容至1L 。過(guò)濾除菌，分裝后4℃ 保存。
注意：因?yàn)楝F(xiàn)在市售HEPES 為約10g 包裝的小瓶，所以可根據(jù)實(shí)際情況靈活配制，但是要保證培養(yǎng)液內(nèi)HEPES 的終濃度仍然為20m mol/L 。如：稱取4.766 克HEPES 溶于20ml 三蒸水中，過(guò)濾除菌后可完全（20ml ）加入1L 培養(yǎng)液中，或者每100ml 培養(yǎng)液中加入2ml 即可。
8. 谷氨酰胺：
合成培養(yǎng)基中都含有較大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，細(xì)胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質(zhì)，谷氨酰胺缺乏要導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)不良甚至死亡。在配制各種培養(yǎng)液中都應(yīng)該補(bǔ)加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，4℃ 下放置1 周可分解50 ％，故應(yīng)單獨(dú)配制，置于-20℃ 冰箱中保存，用前加入培養(yǎng)液。加有谷氨酰胺的培養(yǎng)液在4℃ 冰箱中儲(chǔ)存2 周以上時(shí)，應(yīng)重新加入原來(lái)的谷氨酰胺。
一般培養(yǎng)液中谷氨酰胺的含量為1 ～4mmol/L ?？梢耘渲?00mmol/L 谷氨酰胺液貯存，用時(shí)加入培養(yǎng)液。配制方法為，谷氨酰胺2.922g 溶于三蒸水加至100ml 即配成200mmol/L 的溶液，充分?jǐn)嚢枞芙夂?，過(guò)濾除菌，分裝小瓶，-20℃ 保存，使用時(shí)可向100ml 培養(yǎng)液中加入1ml 谷氨酰胺溶液。
9. 肝素溶液的配制：
含有肝素的培養(yǎng)液可以使內(nèi)皮細(xì)胞純度提高，肝素加入全培養(yǎng)液中最終濃度為50ug/ml 。因?yàn)楝F(xiàn)在市售的多為肝素鈉，包裝為約為0.56 克/ 瓶，配制時(shí)，可將其溶于100ml 三蒸水中，定容，過(guò)夜，然后過(guò)濾除菌，分裝小瓶，保存溫度為 ℃ 。使用時(shí)，向100ml 培養(yǎng)液中加入1ml （精確可加入0.9ml ）即可。
10. Ⅰ 型膠原酶的配制：
0.1 ％Ⅰ 型膠原酶溶液同胰蛋白酶一樣配制和消毒滅菌。注意：因?yàn)棰?型膠原酶分子顆粒比胰酶大，不容易過(guò)濾，因此可以用蔡式濾器過(guò)濾除菌。分裝入10ml 小瓶-20℃ 保存。
11. 明膠溶液的配制：
因?yàn)槊髂z難于過(guò)濾，所以配制0.1 ％明膠溶液必須用無(wú)菌的PBS 配制。所以制備過(guò)程中必須要注意無(wú)菌操作。首要的問(wèn)題是如何無(wú)菌準(zhǔn)確稱量0.1 克（配成100ml 溶液）― 即解決無(wú)菌分裝藥品的問(wèn)題。其次要注意即使是01. 的溶液，明膠也難溶，因此要充分搖勻，過(guò)夜放置，然后無(wú)菌分裝入50ml 小瓶中，4℃ 保存。
四、細(xì)胞培養(yǎng)中配置細(xì)胞培養(yǎng)液注意事項(xiàng)
1. 配制溶液時(shí)必須用新鮮的蒸餾水。
2. 安裝蔡式濾器時(shí)通常使用孔徑0.45 微米和0.22 微米濾膜各一張，放置位置為0.45 的位于0.22 微米的濾膜上方，并且要特別注意濾膜光面朝上。
3. 配制RPMI1640 培養(yǎng)基時(shí)因?yàn)檫€要加入小牛血清，而小牛血清略偏酸性，為了保證培養(yǎng)液PH 值最終為7.2 ，可在配制時(shí)調(diào)PH 至7.4。
